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实验技巧┃石蜡切片技术的前前后后,你确定都了解?

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从今天(tian)起(qi)小编(bian)将会不(bu)定时像大家(jia)分享一些分子实验室常用的实验技巧(qiao),之前J9九游会AG 有分享过关于(yu)细胞培养、RNA提取、qPCR常见问题等内容(rong)点(dian)击链接即(ji)可跳转至内容,今(jin)天呢J9九游会AG 分享的(de)主要内容是关于石蜡切片相关实验的(de)一(yi)些注意事项和(he)技巧。

石蜡切片技术的发展方便了很多科研人员对样本的需求,通过石蜡包埋的样本可以保存数年,并且对保存环境要求不严格,这对于科研人员来说是极大的便利。石蜡包埋的原理是新鲜的样本组织,通过石蜡处理,将石蜡代替了组织中的水分,从而制成切片,并能良好的保存组织和细胞的结构。石蜡切片前期制作较为复杂,包括取材、固定(ding)、洗涤和脱水(shui)、透(tou)明、浸(jin)蜡(la)、包埋┉┉封片等步骤,较为(wei)繁琐

具体实验步骤:

 

取材

根据不同(tong)的(de)(de)实(shi)验目的(de)(de),选择相应的(de)(de)样本,及(ji)(ji)时(shi)放入盛(sheng)有固定(ding)液体的(de)(de)标本瓶(ping)中,组(zu)织要(yao)求新鲜(xian),搁置时(shi)间过(guo)久则产(chan)生蛋白质(zhi)分解变性,导致细(xi)胞(bao)自溶及(ji)(ji)细(xi)菌的(de)(de)滋(zi)生,而不能反(fan)映组(zu)织活体时(shi)的(de)(de)形态结构。

 

固定

固定液的(de)种类很多,其对组织的(de)硬(ying)化(hua)收缩程度以及组织内蛋白(bai)质(zhi)、脂肪(fang)、糖类等物质(zhi)的(de)作(zuo)用各不相同(tong)。固(gu)(gu)定(ding)液的用量一般为材料(liao)的10~15倍或稍多,常规固(gu)(gu)定(ding)时(shi)间为12~48h(根据组织(zhi)块大小而定(ding)),固(gu)(gu)定(ding)能使组织(zhi)硬(ying)化,有利(li)于后续实验顺利(li)进行。

 

洗涤与脱水

固(gu)(gu)定(ding)(ding)后(hou)的(de)(de)组织(zhi)材料(liao)需除去留在组织(zhi)内(nei)的(de)(de)固(gu)(gu)定(ding)(ding)液及其结晶沉淀,否则会影响后(hou)期的(de)(de)染色效果,可(ke)以用(yong)流水(shui)冲洗(xi)数小时(shi)(shi),使用(yong)酒精或就是(shi)混合液固(gu)(gu)定(ding)(ding)的(de)(de)材料(liao),不需要洗(xi)涤,可(ke)直接进入脱(tuo)水(shui)环节,脱(tuo)水(shui)是(shi)为(wei)了因为(wei)水(shui)和透明剂(ji)不互溶,用(yong)酒精脱(tuo)水(shui)后(hou)可(ke)让透明剂(ji)进入组织(zhi),可(ke)用(yong)70%、85%、95%、100%浓度的(de)(de)乙醇(chun)进行脱(tuo)水(shui),脱(tuo)水(shui)时(shi)(shi)间根据组织(zhi)快大小而定(ding)(ding),一般1-2小时(shi)(shi),如果不能(neng)及时(shi)(shi)进行梯度脱(tuo)水(shui),要将组织(zhi)放(fang)入70%的(de)(de)乙醇(chun)中保存(cun)。

 

透明

酒精和(he)石蜡(la)不互(hu)溶(rong),用(yong)二(er)(er)甲(jia)苯替换出组(zu)(zu)织内的酒精。用(yong)的透明(ming)剂有二(er)(er)甲(jia)苯、苯、氯仿、正(zheng)丁醇(chun)等,各种透明(ming)剂均(jun)是石蜡(la)的溶(rong)剂,可先用(yong)一(yi)半的无水乙醇(chun)和(he)一(yi)半二(er)(er)甲(jia)苯混合液浸渍,在换成二(er)(er)甲(jia)苯两次共(gong)40min~2h(根据(ju)组(zu)(zu)织块大小而(er)定)。

 

浸蜡与包埋

是为了让石(shi)蜡浸(jin)入组织替代透明剂(ji),起支持作用,以便包埋。将熔化(hua)蜡(la)倒人包埋盒(he),用温镊子夹取(qu)组织块(kuai)放入盒(he)的中央位(wei)置,待石蜡(la)全部凝结(jie)变硬即(ji)可取(qu)出。

 

修切蜡块

把(ba)包(bao)埋好的蜡块(kuai)用刀片修切(qie)成正(zheng)方(fang)形(xing)(xing)或长方(fang)形(xing)(xing),注意勿太(tai)靠近组(zu)(zu)织,让(rang)组(zu)(zu)织四周留有少许(xu)石蜡,蜡块(kuai)两(liang)边必(bi)须切(qie)成平行的直线,以(yi)免(mian)切(qie)下的蜡条弯曲。

 

固定蜡块

取(qu)小木块,用蜡铲在酒精灯上加热(re),使石蜡块底面熔化一层粘于小木块上,冷却后装(zhuang)在切片机(ji)上。

 

载玻片

取干(gan)净的载玻(bo)(bo)(bo)片(pian)涂(tu)以甘油蛋(dan)白(bai):以玻(bo)(bo)(bo)璃棒尖(jian)端稍(shao)取甘油蛋(dan)白(bai)一(yi)滴(di),轻轻滴(di)于载玻(bo)(bo)(bo)片(pian)中央,常以洗(xi)净的手指加以涂(tu)布,涂(tu)布的面不宜太(tai)广(guang),而以恰恰能够贴附蜡片(pian)为(wei)度。甘油蛋(dan)白(bai)不能涂(tu)布过多,否则,会形成(cheng)白(bai)膜,妨碍(ai)观(guan)察(cha)。

 

切片

注(zhu)意刀的倾角,切片(pian)厚度一般为5-8μm用(yong)毛笔托住蜡带(dai),放在(zai)展片(pian)盒内(水(shui)温宜在(zai)48°C左右(you))展片(pian),刀片(pian)的锋利度与石蜡块的软(ruan)硬(ying)直接影响切(qie)片(pian)质(zhi)量。

 

贴片

蜡带受热(re)即自动展开(kai),也可用拨针(zhen)轻轻拉开(kai)。待蜡(la)片完全(quan)展平后,用滤纸吸去多余水分。注意切片(pian)(pian)和载玻片(pian)(pian)之间不能有(you)气泡,否则在展(zhan)片(pian)(pian)时气泡会(hui)扩大,甚至(zhi)致使切片(pian)(pian)破损、变形,影(ying)响组织观察。

 

烤片

将贴片置人37~62℃恒温(wen)干(gan)燥箱干(gan)燥12h。干燥后片子常(chang)温、阴凉处保存待实验时(shi)用(yong)。

 

以上是关于石(shi)蜡(la)切片的相关技(ji)术操(cao)作,其实在实验中(zhong),石(shi)蜡(la)切片技(ji)术是不容易掌握(wo)的,经常会(hui)由于一(yi)些未知的因素导致切片质(zhi)量差,影响后续(xu)实验,所以下(xia)面小(xiao)编将在切片过程中(zhong)常见的一(yi)些问题及解决方法大(da)致罗列一(yi)下(xia),希望对(dui)大(da)家(jia)的科研有所帮助(zhu)。

 
 

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